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Photoschaltbare Proteine

Photoschaltbare Proteine sind eine besondere Klasse von chromophortragenden Proteinen, die hauptsächlich unter den grün fluoreszierenden Proteinen (GFP-ähnlichen Proteinen) und unter den Bakteriophytochromen (BphPs) zu finden sind. Diese Proteine zeigen die bemerkenswerte Fähigkeit, ihre photophysikalischen Eigenschaften durch Licht zu modulieren. Das heißt, photoschaltbare Proteine können durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen reversibel zwischen einem eingeschalteten Zustand (z.B. Fluoreszenzemission) und einem ausgeschalteten Zustand umgeschaltet werden. Über die unmittelbare Verwendung von photoschaltbaren Proteinen in hochmodernen Bildgebungsverfahren hinaus zeigen sie eine faszinierende – fast haptische – Verbindung zwischen strukturellen Veränderungen und photophysikalischen Eigenschaften.

Diese Proteine waren bereits entscheidend für viele Konzepte (hauptsächlich RESOLFT-Stil) in der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie (Nobelpreis, 2014). In der superauflösenden Fluoreszenz ermöglicht das Schalten die räumliche Modulation der Fluoreszenz, um Emissionspunkte unterhalb der Beugungsgrenze zu erreichen. Eine weitere Verwendung des Photoswitchings besteht darin, Signalbilder zeitlich zu modulieren. Für die Fluoreszenz wurde dies als Kontrastverstärkungsmethode untersucht, fand jedoch nur begrenzte Anwendung aufgrund des allgemein guten anfänglichen Kontrast-Rausch-Verhältnisses in den Proben. Daher richtete ich mein Interesse auf eine aufstrebende Bildgebungsmodalität aus dem biomedizinischen Bereich, die unter schlechtem Kontrast für gezielte Labels leidet: die Optoakustische Bildgebung (auch Photoakustik genannt).

Optoakustik kombiniert optische Anregung mit akustischer Detektion und ermöglicht so hochauflösende Tiefengewebsbildgebung in vivo. Aufgrund des starken natürlichen Kontrasts von Blut-Hämoglobin wird die Methode hauptsächlich angewendet, um die Gefäßstruktur und ihre pathophysiologischen Veränderungen zu visualisieren, beispielsweise als Biomarker für die Tumorentwicklung. Das starke Signal von Gewebechromophoren ermöglicht eine bildgebende Darstellung der Anatomie und Physiologie ohne Labels, verhindert jedoch die Erkennung gezielter Chromophoren. Dies verhindert die Verwendung der Optoakustischen Bildgebung für die meisten lebenswissenschaftlichen Forschungsfragen unter Verwendung gezielter (genetisch kodierter) Reporter und Sensoren.

Der große Durchbruch gelang durch unsere (und andere) Verwendung des Photoswitchings, um das Reportersignal zu modulieren und es vom nicht modulierenden Hintergrund der Gewebechromophoren zu trennen – wodurch der Hintergrund praktisch unsichtbar wird. Dies erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht es den Photoswitching-Reportern, die Visualisierung kleiner Zellzahlen zu ermöglichen, die notwendig sind, um biomedizinische Phänomene in ganzen Lebewesen zu verfolgen, wie beispielsweise die Funktionsweise des Immunsystems. Unsere zukünftige Arbeit wird sich darauf konzentrieren, diese Technologie zur Routineanwendung zu bringen, basierend auf dem Proteinengineering von Photoswitching-Reportern für die Optoakustik sowie, zusammen mit der Gruppe von Vasilis Ntziachristos, der Entwicklung spezieller Instrumente. Letztendlich wird dies eine Ganzkörperbildgebung von genetisch kodierten Reportern mit zellulärer Auflösung ermöglichen; etablierte Methoden wie Biolumineszenz und Ganzkörper-Fluoreszenz in der Auflösung und intravitale Mikroskopie im Sichtfeld und in der Eindringtiefe übertreffen.

 

Weiterführende Literatur

  1. Mishra K, Stankevych M, Fuenzalida-Werner JP, Grassmann S, Gujrati V, Klemm U, Buchholz VR, Ntziachristos V, Stiel AC. Multiplexed whole animal imaging with reversibly switchable optoacoustic proteins. Science Advances. 2020. 22(9):441-446.
  1. Stankevych M, Mishra K, Ntziachristos V, Stiel AC. A practical guide to photoswitching optoacoustics tomography. Methods Enzymol. 657:365-383.
  1. Mishra K, Fuenzalida-Werner JP, Ntziachristos V, Stiel AC. Photocontrollable Proteins for Optoacoustic Imaging. Anal Chem. 91(9):5470-5477.
  1. Vetschera P, Mishra K, Fuenzalida-Werner JP, Chmyrov A, Ntziachristos V, Stiel AC. Characterization of Reversibly Switchable Fluorescent Proteins in Optoacoustic Imaging. Anal Chem. 90(17):10527-10535.
  1. Stiel AC, Deán-Ben XL, Jiang Y, Ntziachristos V, Razansky D, Westmeyer GG. High-contrast imaging of reversibly switchable fluorescent proteins via temporally unmixed multispectral optoacoustic tomography. Opt Lett. 40(3):367-70.