Reif Lab

Die Umwandlung von Proteinen vom löslichen in den fibrillären Zustand ist mit einer Vielzahl von pathologischen Zuständen verbunden, darunter neurodegenerative Erkrankungen und systemische Amyloidosen. Die bekanntesten Beispiele sind Alzheimer, Parkinson und die Prionenerkrankungen. Auch Diabetes Typ 2 ist mit der Ablagerung des Hormons hIAPP in der Bauchspeicheldrüse diabetischer Patienten verbunden. Amyloide zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, an kleine Moleküle wie Thioflavin T oder Kongorot zu binden. Ihre Strukturen zeichnen sich durch einen hohen Anteil an Beta-Faltblättern aus. In den letzten Jahren stellte sich heraus, dass diese Aggregate eine Tertiärstruktur aufweisen und eine gut definierte Faltung bilden. Es ist jedoch noch unklar, wie groß die Konformationsvariationen sind und wie sich diese auf die Zelltoxizität auswirken.

Strukturelle Charakterisierung von Beta-Amyloid-Peptiden (Abeta)

Die Alzheimer-Krankheit ist die häufigste Form der altersbedingten neurodegenerativen Erkrankung. Abeta wird durch Prozessierung von APP, dem Amyloid-Vorläuferprotein, gewonnen. Wir untersuchen Abeta-Fibrillen mittels Festkörper-NMR, um die Mechanismen, die zur Bildung dieser Aggregate führen, besser zu verstehen.
Abeta-Fibrillenstruktur

In den letzten Jahren wurden mehrere Strukturmodelle von Abeta-Fibrillen bei Alzheimer-Krankheit veröffentlicht (Petkova und Tycko, 2006; Paravastu und Tycko, 2008; Xiao und Ishii, 2015; Colvin und Griffin, 2016; Wälti und Riek, 2016). In diesen Strukturmodellen besteht der grundlegende Fibrillenbaustein aus symmetrischen Oligomeren. In Übereinstimmung mit Kryo-Elektronenmikroskopie-Studien haben wir festgestellt, dass Abeta-Polymorphe auch aus asymmetrischen Oligomeren bestehen können (Lopez del Amo et al., Angewandte Chemie 2012). Wir arbeiten derzeit an der Strukturanalyse dieses speziellen Amyloid-Polymorphs. [Bild: Lopez del Amo et al., Angewandte Chemie 2012]
Abeta-Inhibitoren

Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) sind bekannte Gamma-Sekretase-Modulatoren; sie beeinflussen Abeta-Populationen. NSAR sind pleiotrop und können mit mehreren Pathomechanismen interagieren. Wir konnten zeigen, dass das NSAR Sulindacsulfid spezifisch mit Abeta-Fibrillen der Alzheimer-Krankheit interagiert. Sulindacsulfid induziert keine drastischen architektonischen Veränderungen der Fibrillenstruktur, sondern interkaliert zwischen den beiden Beta-Strängen der Amyloidfibrille und bindet an hydrophobe Hohlräume, die in allen analysierten Strukturen konsistent gefunden wurden (Prade et al., JBC 2015; Prade et al., Biochemistry 2016). Mithilfe von chemischen Verschiebungsstörungen und 19F-13C-Abstandsbeschränkungen aus REDOR-Experimenten bestimmen wir die Bindungsstelle dieser kleinen Moleküle. Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichen die Entwicklung wirksamerer Moleküle zur zukünftigen Behandlung der Krankheit. [Bild: Prade et al., JBC 2015]
Wechselwirkungen zwischen kleinen Hitzeschockproteinen und fehlgefalteten Proteinen

Kleine Hitzeschockproteine, einschließlich αB-Kristallin (αB), spielen eine wichtige Rolle in der Proteinhomöostase, da ihre ATP-unabhängige Chaperonaktivität die unkontrollierte Proteinaggregation hemmt. Mechanistische Details des menschlichen αB, insbesondere im clientgebundenen Zustand, waren bisher schwer fassbar, was unter anderem auf das hohe Molekulargewicht und die Heterogenität dieser Komplexe zurückzuführen ist. Mittels NMR-Spektroskopie haben wir gezeigt, dass der αB-Komplex aus asymmetrischen Bausteinen aufgebaut ist. Interaktionsstudien haben gezeigt, dass das fibrillenbildende Alzheimer-Peptid Aβ1–40 bevorzugt an einen hydrophoben Rand des zentralen β-Sandwichs von αB bindet. Im Gegensatz dazu wird das amorph aggregierende Klienten-Lysozym von der teilweise ungeordneten N-terminalen Domäne von αB eingefangen. Wir vermuten, dass αB seine inhärente strukturelle Plastizität nutzt, um unterschiedliche Bindungsschnittstellen freizulegen und so mit einer breiten Palette strukturell variabler Klienten zu interagieren (Mainz et al., Nature Struct. Mol. Biol. 2015). [Bild: Mainz et al., Nature Struct. Mol. Biol. 2015]

Die Relaxationsrate eines Kerns in der Lösungs-NMR wird durch die Taumelrate des Moleküls bestimmt. Typischerweise nimmt die Linienbreite bei größeren Molekülen zu, was die Charakterisierung von Molekülen über 100 kDa zunehmend erschwert. Die Festkörper-NMR ist nicht durch die Taumelkorrelationszeit limitiert, da die Moleküle immobilisiert sind. Daher ist die experimentelle Linienbreite unabhängig von der Molekülgröße. Die Immobilisierung des Moleküls kann durch Kristallisation, aber auch durch Erhöhung der Viskosität der Lösung erreicht werden. Dieser Ansatz wurde am Beispiel des kleinen Hitzeschockproteins αB-Crystallin demonstriert. Diese Technik eröffnet neue Perspektiven für die Untersuchung großer Proteinkomplexe, da Liganden zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen nicht mitgefällt werden müssen.

[Abbildung: MAS-NMR 13C,13C-Korrelationen, durchgeführt für das kleine Hitzeschockprotein αB-Crystallin (600 kDa) in Lösung. Mainz et al., J. Am. Chem. Soc. 2009]
Proteasomkomplexe

Verschiedene zelluläre Prozesse werden durch große molekulare Maschinen reguliert. Der Abbaumechanismus des Proteasoms ist essenziell für die zelluläre Proteinhomöostase und -lebensfähigkeit. Wir konnten zeigen, dass eine Kombination aus Magic-Angle-Spinning (MAS) und Protonendetektion es ermöglicht, sequenzielle Rückgratzuordnungen für einen Megadalton-Archaeen-Proteasomkomplex zu erhalten, ohne dass eine Proteinkristallisation oder -fällung erforderlich ist. Die Rotationsdiffusion des gelösten Proteinkomplexes wird durch MAS-induzierte reversible Sedimentation beeinträchtigt. Dieser Ansatz ermöglicht die Erforschung der Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen supramolekularer Aggregate im Megadalton-Bereich (Mainz et al., Angewandte Chemie 2013).
Ribosomale Komplexe

Die cotranslationale Proteinfaltung ist trotz hochauflösender Ribosomenkristallstrukturen noch nicht gut verstanden. In vorläufigen Experimenten konnten wir zeigen, dass die nicht-mobilen Regionen eines prokaryotischen Ribosomenkomplexes mittels Festkörper-NMR untersucht werden können. Dieser große asymmetrische Proteinkomplex (1,4 MDa) wird durch die kombinierte Anwendung von Protonendetektion und hohen MAS-Frequenzen (60 kHz) zugänglich. Diese Experimente eröffnen neue Perspektiven für das Verständnis der Mechanismen großer molekularer Maschinen (Barbet-Massin, Angewandte Chemie 2015).

Festkörper-NMR-Experimente zur Messung von Abständen oder Torsionswinkeln zwischen Heteroatomen sind bislang auf doppelt markierte Peptid- oder Proteinproben beschränkt. Wir entwickeln Experimente, die sich zur Charakterisierung der Struktur einheitlich markierter Peptide und Proteine ​​eignen. Darüber hinaus entwickeln wir Markierungskonzepte, die eine hochempfindliche Detektion von Protonen ermöglichen. Diese Strategien basieren auf der Perdeuterierung des Proteins mit Rücksubstitution der austauschbaren Deuteronen durch Protonen aus dem Lösungsmittel. Das obige Spektrum zeigt ein HSQC-Spektrum der α-Spectrin-SH3-Domäne, aufgenommen im Festkörper. Die erreichbare Auflösung ist vergleichbar mit der Auflösung, die in Lösungs-NMR für ein Protein mittlerer Größe erreicht wird. (Chevelkov et al., Angewandte Chemie Int. Edt. 2006; Linser et al., J. Am. Chem. Soc. 2010)
Ein Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf der Quantifizierung dynamischer Prozesse. Festkörper-NMR ist wie keine andere Methode zur Beschreibung dynamischer Prozesse geeignet. In Lösung ist der Großteil der Relaxation auf allgemeines Taumeln zurückzuführen. Im Festkörper hingegen beruht die Relaxation ausschließlich auf lokalen Strukturfluktuationen. Die obigen 1D-15N-Spektren sind Querschnitte entlang der 15N-Dimension in einem HSQC-Experiment, das ohne skalare Entkopplung in t1 aufgezeichnet wurde. Dementsprechend sind die Signale in Dubletts aufgespalten. Die Intensitäten der 15N-1H(α)- und 15N-1H(β)-Spinzustände sind aufgrund der kreuzkorrelierten Dipol-CSA-Relaxation asymmetrisch. Die differenzielle Relaxation der Multiplettkomponenten ist auf lokale Strukturfluktuationen im Nanosekundenbereich zurückzuführen.

In Zusammenarbeit mit Prof. Nikolai Skrynnikov von der Purdue University vergleichen wir die dynamischen Eigenschaften der α-Spectrin-SH3-Domäne im kristallinen Zustand und in Lösung. Wir stellen fest, dass die Bewegungseigenschaften sehr ähnlich sind. Dies eröffnet neue Perspektiven für die dynamische Charakterisierung eines Proteins. Die Abbildung zeigt die Korrelation der Methyl-13C-R1-Relaxationsraten für die α-Spectrin-SH3-Domäne in Lösung und im Festkörper. Auch ohne den Korrekturterm, der das allgemeine Taumeln berücksichtigt, sind die Relaxationsraten sehr ähnlich (Agarwal et al., J. Am. Chem. Soc. 2008).